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化學(xué)發(fā)光底物的原理與用途
  • 發(fā)布日期:2022-08-01      瀏覽次數(shù):1783
    •        辣根過(guò)氧化酶使試劑中的發(fā)光物(luminol)氧化并發(fā)光,而試劑中含有增強(qiáng)劑這使得發(fā)光增強(qiáng)了1000倍。在免疫印跡中,將復(fù)雜的蛋白混合物經(jīng)sds-page分離,并轉(zhuǎn)移到固相膜上(如nc、pvdf)等,用于免疫學(xué)檢測(cè),經(jīng)HRP標(biāo)記的抗體與膜上的蛋白直接(標(biāo)記一抗)或間接(標(biāo)記二抗)反應(yīng)。

       原理

       辣根過(guò)氧化酶使試劑中的發(fā)光物(luminol)氧化并發(fā)光,而試劑中含有增強(qiáng)劑這使得發(fā)光增強(qiáng)了1000倍。在免疫印跡中,將復(fù)雜的蛋白混合物經(jīng)sds-page分離,并轉(zhuǎn)移到固相膜上(如nc、pvdf)等,用于免疫學(xué)檢測(cè),經(jīng)HRP標(biāo)記的抗體與膜上的蛋白直接(標(biāo)記一抗)或間接(標(biāo)記二抗)反應(yīng)。當(dāng)加入免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑后,luminol發(fā)生氧化降解,并發(fā)射波長(zhǎng)為428nm的光,此光可經(jīng)x光膠片(放射自顯影片)感光記錄下來(lái)。

      用途

      非放射性發(fā)光系統(tǒng),用于檢測(cè)固定在膜上的蛋白,其敏感性達(dá)1-5pg。用x光片可快速地獲得永.久的硬拷貝結(jié)果。所含獨(dú).特的底物足以維持12小時(shí)以上的發(fā)光,便于反復(fù)曝光操作,免疫印跡膜經(jīng)抗體脫卸處理后可供再次抗體探查使用。適用于痕量蛋白或核酸檢測(cè)。

      使用方法

      1. 印跡膜制備 按常規(guī)方法完成SDS-PAGE和電轉(zhuǎn)膜操作,適當(dāng)?shù)姆忾]非常重要。可以通過(guò)標(biāo)記一抗或二抗的手段引入HRP,一般采用市售的HRP二抗交聯(lián)物。仔細(xì)地淋洗對(duì)于降低背景非常重要,在與HRP交聯(lián)物溫育后,膜片更需仔細(xì)洗滌,所有步驟均在室溫下完成。

      2. 化學(xué)發(fā)光試劑的配置 在使用前等量混合a液和b液,混合后盡快使用。將膜片置混合液中于室溫下振蕩溫育2分鐘,每平方厘米膜片至少使用0.1-0.2ml以覆蓋全膜片。
      3.蛋白信號(hào)顯現(xiàn)
      1). 用平頭鑷鉗住膜片,垂直置于吸水紙以吸去過(guò)量試劑。
      2). 置膜片于二層保鮮膜之間,小心趕盡氣泡。
      3). 將膜片吸附蛋白面朝上,置于x光片盒中。
      4). 于暗室中壓上x(chóng)光片。
      5).根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間,一般為1min或5min,也可選擇不同時(shí)間多次壓片,以達(dá)最佳效果。顯影沖洗。
      6). 調(diào)節(jié)曝光時(shí)間,再次曝光顯影。
      4、膜的重復(fù)使用:
      配置62.5mm tris-hcl,ph6.7,2%sds, 7ml/100ml的巰基乙醇的溶液,膜放入后,70?c振蕩水浴30分鐘。再用tbst或pbst緩沖液洗脫,最后用bsa(牛血清白蛋白)或牛奶封閉。


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